Mario Lemieux fut choisi au premier rang lors du repêchage amateur de 1984 par les Penguins de Pittsburgh. Il débuta sa carrière dans la LNH cette saison-là, marquant un but lors de son premier tour sur la patinoire contre les Bruins. Au cours de sa première saison, Mario a totalisé 100 points et remporté le trophée Calder. En 1985-86, alors qu’il n’avait pas encore atteint ses 18 ans lors du match inaugural, il enregistra un époustouflant 141 points alors que les Penguins récoltaient 23 points de plus au classement général et marquaient plus de buts qu’ils n’en avaient alloué, pour la quatrième fois seulement dans leurs 19 années d’existence. Au terme de la saison, Mario mérita le prix Lester B. Pearson décerné par les joueurs de la Ligue au meilleur des leurs. Après avoir enregistré 107 points en 63 matches seulement en 1986-87, Mario mit la vapeur en 1987-88 et termina la saison en tête des marqueurs avec 70 buts et 168 points pour mériter son premier trophée Art Ross (meilleur marqueur), son premier trophée Hart (joueur le plus utile) et son deuxième Lester B. Pearson. Lors du Match des étoiles cette année-là, Mario marqua trois buts et obtint trois aides.
En 1988-89, Mario connut sa meilleure saison offensive dans la Ligue avec 85 buts, 114 aides, 199 points, 31 buts en avantage numérique et 13 buts en désavantage numérique (un record). Cette année-là, il mérita son deuxième trophée Art Ross consécutif alors que les Penguins se taillèrent une place en séries éliminatoires pour la première fois en sept ans. Le 25 avril 1989, il marqua cinq buts et obtint trois aides dans un gain de 10-7 contre les Flyers, et égalant un record de la Ligue avec quatre buts en première période. En 1989-90, Mario ne participa qu’à 59 matches, mais parvint quand même à enregistrer une série de 46 matches consécutifs avec au moins un point. Il termina la saison avec 123 points. En 1990-91, sa saison régulière fut limitée à 26 parties (45 points), mais il aida les siens à mériter leur premier titre de division (Patrick) de leur histoire. Au cours des éliminatoires, Mario marqua 16 fois et obtint 44 points alors que les Penguins remportèrent leur première coupe Stanley. En récompense de ses efforts, Mario reçut le trophée Conn Smythe à titre de joueur le plus utile pendant les séries.
En 1991-92, les Penguins glissèrent en troisième place au classement de la division Patrick, mais Mario mérita malgré tout son troisième trophée Art Ross avec 131 points en 64 matches seulement. Au cours des séries, Mario prit la tête des marqueurs avec 16 buts et 34 points (en 15 matches seulement) pour mériter un deuxième trophée Conn Smythe et une deuxième bague de la coupe Stanley. En 1992-93, Mario connut une saison du tonnerre alors qu’il enregistra 160 points en 60 matches. On lui remit le trophée Art Ross pour une quatrième fois. Il mérita aussi son troisième prix Pearson et son deuxième trophée Hart, et il mena la Ligue au chapitre des plus et des moins avec +55. Après que les Penguins eurent remporté leur premier trophée du Président à la fin de la saison régulière, Mario enregistra 18 points en 11 matches éliminatoires et son équipe se rendit en deuxième ronde des séries pour une troisième fois en quatre ans. Après n’avoir joué que 22 parties en 1993-94, Mario ne joua pas en 1994-95 pour se remettre de blessures au dos.
En 1995-96, Mario revint au jeu et remporta un cinquième championnat des marqueurs (161 points), un quatrième prix L. B. Pearson et un troisième trophée Hart alors que les Penguins méritèrent un quatrième titre de division. Cette année-là, il égala son record personnel de 31 buts en avantage numérique et remporta son troisième titre de meilleur marqueur de la Ligue avec 69 buts. Mario joua sa dernière saison en 1996-97 et remporta un sixième titre de champion marqueur avec 122 points.
Après une sabbatique de trois ans et demi, Mario fit un retour au jeu le 27 décembre 2000, marquant un but et obtenant deux aides dans une victoire de 5-0 contre les Maple Leafs. Lors du match suivant, Mario aida Jaromir Jágr à enregistrer un 1000 e point en carrière et se paya le luxe d’un 1500 e point pour lui-même. À la fin de la semaine, Mario partagea le titre du joueur de la semaine avec Jágr. Le 24 janvier, Mario enregistra un 40 e tour du chapeau dans la LNH lors d’un gain de 3-1 contre les Canadiens dans sa ville natale, Montréal. À la fin du mois de janvier, Mario reçut le titre de joueur du mois et participa ensuite au Match des étoiles pour une neuvième fois en carrière. Malgré qu’il ne joua que 43 matches cette année-là, il marqua 35 buts et obtint 71 points, et prit la tête chez les siens avec 16 buts en avantage numérique et un pourcentage de tirs au but de 20,5.
En 2001-02, Mario ne participa qu’à 24 matches, mais parvint quand même à enregistrer 31 points. Le 27 février, il devint le septième joueur de toute l’histoire de la LNH à atteindre le plateau des 1600 points. En 2002-03, son état de santé lui permit de jouer dans 67 matches seulement, mais il mena chez les siens avec une moyenne de 1,36 points par match. Malgré qu’il ait raté 15 parties, il se classa huitième au classement des marqueurs avec 91 points. Il termina au troisième rang avec 63 aides et 31 aides en avantage numérique, en plus de mener chez les siens avec 28 buts, quatre buts vainqueurs (égalant un record), 14 buts en avantage numérique et 235 tirs au but. Les Penguins, toutefois, ratèrent les séries éliminatoires pour une deuxième année consécutive. En février, il participa au Match des étoiles et, plus tard ce mois-là, il enregistra une 1000 e assistance lors d’un gain de 5-2 contre les Bruins.
En 2003-04, il ne participa qu’à 10 parties, mais parvint tout de même à amasser neuf points. Pendant ce temps, son équipe chuta au dernier rang du classement global pour la première fois